客服電話:400-026-8886

進入線上商城

登錄  |  註冊

引物合成常見問題解答

作者:上海捷瑞生物工程有限公司 瀏覽:396 發表時間:2020-03-02 14:20:08
引物合成常見問題解答


引物是如何合成的

>>>>>>>

目前引物合成基本採用固相亞磷酰胺三酯法。DNA合成儀有很多種,無論採用什麼機器合成,合成的原理都相同,主要差別在於合成產率的高低,試劑消耗量的不同和單個循環用時的多少。

(1) 去保護:加入Deblocking脱去鹼基上5'- OH的保護基團DMT,獲得遊離的5'- OH;

(2) 耦合:同時加入活化劑和新的鹼基,新的鹼基5'-OH仍然被DMT保護,3'端被活化與溶液中游離的5'-OH發生耦合反應;

(3) 封閉:耦合反應中極少數5'- OH沒有參加反應,用封閉試劑終止其後繼續發生反應;

(4) 氧化:加入氧化劑使其由核苷亞磷酸酯形成更穩定的核苷磷酸酯。

引物合成後如何處理

切割與脱保護基:將合成好的寡核苷酸鏈從支持物上化學切割下來。常用新鮮的濃氨水來裂解CPG與初始核苷之間的酯鍵。斷裂下來的寡核苷酸帶有自由的3'羥基。

純化:根據所合成寡核苷酸的組成和應用來選定純化的方法。常用的純化方法有:C18、OPC、PAGE和HPLC。

定量:根據寡核苷酸在260nm處的紫外吸收來定量。

儲存:分裝抽乾。

需要什麼級別的引物


根據實驗需要,確定訂購引物的純度級別。

應用 引物長度要求 純度級別要求 

一般PCR擴增 < 60base OPC >60 base PAGE 

診斷PCR擴增 < 40base OPC, PAGE 

DNA測序 20base左右 OPC 

亞克隆,點突變等 根據實驗要求定 OPC PAGE,HPLC 

基因構建(全基因合成) 根據實驗要求定 OPC PAGE 

反義核酸 根據實驗要求定 OPC  PAGE 

修飾引物 根據實驗要求定 PAGE, HPLC 


如何計算引物的Tm值

引物設計軟件都可以給出Tm,與引物長度、鹼基組成及所使用緩衝夜的離子強度有關。

長度為25base以下的引物,Tm計算公式為:Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)

對於更長的寡聚核苷酸,Tm計算公式為:

Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (GC%) - 600/size

*公式中,Size =引物長度。



引物的質量是不是和序列有關?

>>>>>>>

四種鹼基的性質和各自保護基的性質都有差別。所以合成難度是不一樣的。難度最大的當屬GC重複多的和序列中還有多個連續的G的引物。尤其對於後者,一般公司都做不了20個G以上的引物。實驗證明,如果引物中有超過三個連續G的結構,傳統方法得到的產物質量就會開始下降。而且目前通用的脱鹽、OPC和PAGE方法都無效。


如何保存引物

引物合成後,經過一系列處理和純化步驟,旋轉幹燥而成無色或白色絮狀乾粉。

幹 粉:運輸時常温運輸,-20℃可以保存一年。

儲存液:配好後分裝成幾管,避免反覆凍融,-20℃可以保存半年。

工作液:常規使用,4℃保存,也可-20℃保存,但應避免反覆凍融。

修飾熒光引物:需要避光保存,儘快使用為宜。


友情鏈接://www.hstbio.cn

 

  

引物合成    |    基因合成    |    企業榮譽   |    

分子產品    |    關於我們    |    聯繫我們   |

  



產品中心    |    電動螺絲刀    |    電鑽工具   |    平砂磨機   

關於我們    |    新聞中心   |   聯繫我們   |   在線留言

Copyright © 上海捷瑞生物工程有限公司 db 2019, All Rights Reserved

 滬ICP備10038784號-1   滬公網安備 31011702006560號